在植物中建構雙固碳系統的挑戰：專訪中研院農生中心呂冠箴

沒那麼簡單：設計人工代謝途徑

呂冠箴原本的研究領域為植物的澱粉代謝，澱粉即是碳水化合物組成，做著做著，她對植物的碳代謝越來越感興趣。

念完博士後，她看到中研院廖俊智院長回臺，正在研究一個她沒想過的方向。「他做合成生物學，設計人工的代謝途徑。我覺得很有趣，因為以前只專注在研究代謝途徑上的分子調控機制，未曾研究合成的代謝途徑，這類的設計在實際植物上的驗證很少。」

於是，她加入了廖俊智的實驗室，從博士後開始投入 McG 循環在植物裡的實作，將人工設計用來增強固碳的 McG 循環（全名 malyl-CoA-glycerate pathway，縮寫為 McG，實際念起來像 Magic），以基因轉殖方式置入植物裡。

然而，呂冠箴很快就發現，合成生物學要做出成果，需長時間不斷嘗試各種方法，跟她原本想像的完全不同。「要做到有一定的科學影響力（scientific impact），不是短時間一兩年就可以達成的。從設計把外源基因放進去在植物裡，確定它們運作，然後怎麼把它的效能調到最好，這些事情沒那麼簡單。」

沒那麼簡單是什麼程度呢？從加入團隊到論文發表，經歷八年的研究探索。

藍綠菌做得到，植物不一定做得到

在 McG 固碳循環放進阿拉伯芥之前，研究團隊已經在藍綠菌裡驗證成功。呂冠箴一開始也覺得，既然藍綠菌能做到，植物應該不會太難吧。

「完 • 全 • 不 • 一 • 樣。」她笑著回憶。

藍綠菌為原核生物，單細胞、沒有複雜的胞器，它是可以做光合作用的細菌，結構簡單，基因表達也簡單。「它不需要很多個啟動子（promoter，即基因的開關）去讓每個基因表現。一個啟動子後面接兩三個不同的基因，就可以一次表現出來。」呂冠箴說。

But！植物完全不同。她接著解釋，每一個基因都需要自己的啟動子才能表現。McG 循環需要六個外源基因，就是六套各自獨立的表現系統。更麻煩的是，這些基因不能隨便放，它們必須在葉綠體裡面工作，因為葉綠體才是光合作用發生的地方。

「要讓基因在葉綠體裡面表現，我們就得要給它一個胜肽（peptide），帶領著我們要表現的蛋白質進去葉綠體。然後我們還要實際偵測，基因是否真的有表現出來。」

而且六個基因所編碼的酵素，分別來自五種不同的細菌和藻類，皆為植物以外的生物體。研究團隊刻意選擇外來基因，是為了避開植物自身的調控，才不會互相干擾。「植物本身也沒有這些基因，植物不認得它，那基因可能就比較不容易被植物調控和干擾。」呂冠箴解釋。

不只六個基因，真的要說其實是七個

當初論文發表時，新聞上都寫著「引入六個外源基因」，但呂冠箴透露，實際上應該要算成七個。

「有一個基因，它表現出來的蛋白質是一個複合體，需要兩個不同的蛋白質結合在一起才有功能。」呂冠箴提到，來自莢膜甲基球菌的蛋白質（MTK 酵素），是由兩個次單元組裝在一起，成為蛋白複合體，才能發揮催化代謝反應的功能。

如果老老實實地把兩個基因分開放，那就又要多一套啟動子、多一套導引胜肽，還要祈禱兩個蛋白質在植物細胞裡能自己找到彼此、結合在一起並發揮功能。「這樣事情就會變得更複雜，不是那麼容易辦到。」呂冠箴強調。

呂冠箴的做法是先在大腸桿菌裡嘗試，把兩個次單元設計成一個融合蛋白（fusion protein），兩顆變一顆。如此只要一個基因、一套表現系統就搞定。但是，中間的胜肽連接片段（linker）要多長、需要搭配什麼序列才不會影響蛋白質的功能，都要反覆測試。「這些就是實際做的過程才會發現的困難點」呂冠箴說。

她還提到，有些基因在試管裡的酵素活性很好，放進植物裡就是不太愛表現。「這些我們也不能用，所以其實中間做了很多嘗試。」

最後，六個基因因為整體太大，沒辦法塞在同一個質體上丟進植物。質體（plasmid）是科學家用來運送基因的小型環狀 DNA，塞太多基因就會裝不下。而且，實驗需要有對照組驗證，也要有只表現部份 McG 基因的轉殖株。

所以研究團隊把這六個要轉殖表現的 McG 基因，拆成兩組：Mc 組（PPC、MTK、MCL）和 G 組（GDH、GCL、TSR），分別轉殖之後，透過雜交再篩選出帶有完整 Mc 與 G 的轉殖株，McG 循環的建構就此完成！「植物沒有辦法一次抓這麼大的東西進去，我們就把它拆成兩半，各種組合也都有了」呂冠箴如此說著。

天然、人造，兩個循環要怎麼一起跑？

基因放進去了、蛋白質也表現了，接下來的問題是：McG 循環在植物體內到底怎麼跟原有光合作用的卡爾文循環協同運作？簡言之，卡爾文循環會不小心浪費一些碳，McG 循環就是把這些碳回收再利用，拿去產油。

呂冠箴解釋，卡爾文循環的酵素 RuBisCO 會抓二氧化碳，但也會抓氧。抓了氧就會產生二碳的乙醇酸（glycolate），這個東西對植物是個負擔。植物原本的處理方式是把乙醇酸送出葉綠體，經過一連串光呼吸作用的反應，把兩個二碳的乙醇酸變成一個三碳的甘油酸（glycerate），再送回卡爾文循環。但是，過程中要丟掉 25% 的碳，還會消耗能量。

McG 循環就像開闢了一條快速道路，直接在葉綠體裡把乙醇酸抓起來，轉換成產油的關鍵前趨物：乙醯輔酶 A（acetyl-CoA）。過程中會釋放一顆碳（CO₂），但循環裡有一個額外的固碳酵素 PPC 會從環境中再抓一顆碳酸氫根（HCO₃^–）補回來，所以碳沒有淨損失。「兩份的兩碳換兩份的兩碳，沒有碳的流失。」呂冠箴強調。

不過 McG 循環的功能不只是回收廢棄物，它跟卡爾文循環之間還有連結：卡爾文循環產生的三碳化合物可以過來，加上一個碳酸氫根（HCO₃^–）變成四碳，再做出兩個乙醯輔酶 A。「它是一個雙固碳系統。」呂冠箴說，McG 循環能和自然界既有的卡爾文循環一起協同運作。

那植物會不會全部都走新路線，不走原本的光呼吸了？「我們沒有把它去掉。因為我們覺得它有一定存在的價值。」呂冠箴解釋，光呼吸途徑是植物某些氨基酸（如甘胺酸、絲胺酸）的合成來源，不能完全廢掉。「我們只是把可能可以不用浪費掉的碳抓住，用比較有效率地的途徑去產乙醯輔酶 A。」

其實在 McG 之前，已經有團隊嘗試過比較簡化的做法，例如用三個酵素把光呼吸的二碳產物快速轉成三碳，也就是走 G 組途徑（GDH、GCL、TSR）回到卡爾文循環。「效果有一些，植物長得好一些，澱粉也多些」呂冠箴說，「不過效果跟我們這個雙循環不同，McG 植物是可以多產油」差別在於，G 組版本把碳送回卡爾文循環去合成葡萄糖，而 McG 可減輕卡爾文循環負擔，提供另一條路讓二碳可以直接轉成乙醯輔酶 A 去合成油脂，過去並沒有團隊這樣做過。

GDH：最重要的拼圖

訪談中聊到關於自己在這篇論文裡最獨到的貢獻，呂冠箴先是笑了一下，然後認真講述選擇 GDH 酵素的由來。

McG 循環的概念是廖俊智院長設計的，之前也有人嘗試把部分循環放進植物裡，但效果一直不穩定。呂冠箴一開始循前人路線，先放五個基因（PPC、MTK、MCL、GCL、TSR），也就是 McG 循環圈圈上面的五個酵素。

「放五個，如果只有這個圈圈的話，其實效果看不太出來。」她回憶，「我實際看到時，好吧，可能有稍微大一點，看起來好像有多點油。但也就這樣，好像還不太夠。要不然……把這個也放進去看看好了，反正都已經做這麼久了。」

「這個」就是 GDH 酵素（glycolate dehydrogenase），可以把光呼吸作用的產物乙醇酸直接回收，並拉進 McG 循環的關鍵酵素。

呂冠箴提到，之前研究團隊在藍綠菌裡沒有放 GDH，這是因為藍綠菌的光呼吸本來就不旺盛。而且使用 GDH、GCL、TSR 這三個酵素把乙醇酸轉成甘油酸的路徑，已經有文獻做過，呂冠箴一開始反而是刻意不放。「當初想說，我想要跟人家不一樣，所以剛開始也只做一個圈。」

後來她才發現，GDH 就是那塊最重要的拼圖。當呂冠箴將 GDH 放進植物之後，結果出乎意料，雙固碳系統順利運作起來了！

GDH 開通了光呼吸產物進入 McG 循環的入口，讓循環有了第二個碳來源。沒有 GDH 的時候，McG 循環只能從卡爾文循環那邊抓三碳來用，但卡爾文循環自己也需要三碳去做糖，兩邊搶資源，效果自然有限。

「雙固碳循環不能缺少 GDH，缺的時候它就會去搶卡爾文循環的碳過來用，那就得此失彼。」她說。

論文數據也支持這個觀察：拿掉 GDH 之後的 McG 植株，生長增強效果大幅下降。而且在高二氧化碳環境下（光呼吸幾乎被抑制），該 McG 植株和野生型的差距也縮小了。證據指向同一結論：把光呼吸產物回收進 McG 循環，是整個雙固碳系統效果顯著的關鍵。

GDH 路徑並非呂冠箴第一個想到的，但她的判斷和執行促成了這篇論文的發現，她決定在阿拉伯芥植物裡面把 GDH 加回來，並看到了前所未見的生長效果。

「這真的是菜吧？」巨大多葉的阿拉伯芥誕生

放了 GDH 之後，植物的反應遠遠超出預期。呂冠箴原本只期待多產一些油脂，頂多固碳效率提升 20%~30%。

「結果我記得大概兩年前，差不多這個時候。我放了一個假回來，去澆水的時候就發現，怎麼有一些植物特別的大！」

她找了廖院長來看，院長也認同植物真的有比較大。又找了農生中心的葉國楨主任來看。「他說，哇，不只比較大，它還長比較多葉子。」

不管是四週、六週或七週，McG 植物都持續跟野生型拉開差距。呂冠箴拿出照片的時候自己也忍不住笑：「這真的是菜吧？」

但是為什麼呢？乙醯輔酶 A 增加後，油脂變多可以理解。但植物長這麼大、葉子這麼多，完全超出碳收支的計算預測。「你說它可以有比較少的碳流失，那也頂多就是多了三分之一的碳可以被利用。那為什麼可以植物長這麼大？很奇怪。」

她和團隊開始找尋原因。發現葉綠體裡面的膜結構（葉綠餅）變多了，膜上面負責光合作用的蛋白質也增加了。脂質不只是跑去變成油滴，還拿去做了更多的膜。更多膜、更多光合蛋白、更好的光合效率——形成一個正向循環。

採訪團隊問：「是不是有點像人在健身吃高蛋白，然後肌肉可以長比較多？」呂冠箴笑著說：「對！沒錯！」

不過其中確切的機制仍然是謎。為什麼乙醯輔酶 A 增加會連帶讓光合蛋白上升？「那就是後續研究要探討的事情，我們還不知道為什麼增加乙醯輔酶 A 會造成這麼多奇奇怪怪的影響。」

從博士後到登上《Science》

從呂冠箴加入廖俊智院長實驗室，到論文被《Science》接受，整整八年，光是從投稿到稿件接受就花了一年半。而且在她加入之前，廖院長團隊已進行了近十年的固碳研究。

「七～八年有哦，要算八年。」她說。

從論文作者群來看，這篇是跨領域的研究。最初是呂冠箴一個人做，遇到什麼問題就去請教其他中研院單位。「看到植物怎麼長這麼大的時候，我們就請吳素幸老師來看，還有葉國楨老師來看。大家看到就，哇，這是很 surprise 的東西。然後就引起大家的共鳴，想要把它好好做好，發表出去。」

接下來就是集思廣益、分頭執行。在顯微鏡下看到油滴之後，呂冠箴想要知道到底是什麼油、有多少。她畢竟不是做油脂分析的人，「我們反正就去問中研院的人，有人會做，有人可以幫忙分析到底是什麼油。那我們就來合作。」

電子顯微鏡、代謝體分析、蛋白質體分析，這些都來自中研院核心設施和不同所的專家合作。「在中研院，不管我想要做什麼，就剛好都可以找到會做的人，都是很厲害的專家！」

呂冠箴強調，論文審查者（reviewer）問的每一個問題，皆需要額外的實驗來回答，而每一個實驗都有可能牽涉另一個領域的專業。「所以就又請教了不同領域專家，我覺得中研院環境真的很好。」

八年時間，從博士後到助研究員。呂冠箴擔任研究職位的第一年，還正在想辦法讓這篇論文發表出去。

論文發表之後，基礎研究繼續往下走。下一步是什麼？呂冠箴說團隊已經開始把 McG 循環放進水稻裡，但目前還在早期階段。每一種作物都是全新的挑戰，同樣的六個基因，在不同植物裡的表現量、穩定性、跟原有系統的相容性，全部要重新摸索。

沒那麼簡單的科學之路

訪談最後，我們問了一個大哉問：對你來說，科學是什麼？

「我覺得這題超難的欸。」呂冠箴笑著說。

她想了想，給了我們來自第一線的科學觀察。「基礎科學是一定要持續進行的。有些人做比較應用的，有些人專注在純科學的路上。我覺得這兩條路其實不是分開的。」

她用自己的研究舉例：McG 循環一開始像是應用研究（增加固碳、產油），但做出來之後，反而開啟了一堆基礎問題。例如：為什麼乙醯輔酶 A 增加會讓植物變大？是哪個代謝物觸發了什麼訊號？她充滿興致地說：「說不定接下來可以找到植物為什麼變大的機制，那我們就又可以拿出來用。說不定不用放那麼多基因？它說不定是一個代謝機制去觸發讓植物變大？」

呂冠箴認為：「沒有什麼簡單的路。」那為什麼會想要一直做下去呢？她回答：「興趣、好玩和好奇。享受在中間發現新東西的樂趣。」

她舉了 CRISPR 的例子：本來只是發現細菌裡面有這個現象，沒人知道能拿來幹嘛。慢慢累積，後來才變成革命性的基因編輯工具。「有時候你發現了一個東西，可能現在還看不出什麼發展性。但慢慢累積，就有了。不可能沒有純科學、基礎研究，就直接去做應用。」

McG 植物也是如此。用 GDH 回收光呼吸產物，過去已經有基礎科學的文獻探索過，呂冠箴成功把它跟與 McG 循環結合在一起，放進葉綠體，就是讓 Magic 轉變成現實的關鍵。