一瞬之光 XFEL 顯微術：人類首次捕捉酵素修復 DNA 損傷的動態過程！

XFEL：更快更亮的顯微之光

「研之有物」在 2019 年曾經訪問蔡明道，當時他利用冷凍電子顯微鏡，拍攝了宛如藝術品的酵素分子立體結構，詳細請參閱〈「把生物分子看得更清楚！」結構生物學最新神器—冷凍電子顯微鏡〉。冷凍電子顯微鏡是結構生物學的一大突破，可以獲得原子級的空間解析度，讓生物大分子「粒粒分明」。

不過，如果要知道酵素修復 DNA 損傷的那個「瞬間」發生什麼事，除了看清楚分子結構，我們更需要「時間解析度」。於是，「時間解析序列飛秒晶體學」（time-resolved serial femtosecond crystallography, TR-SFX）因應而生，專門研究如何捕捉發生在 10^-15 秒（飛秒）時間級距的分子動態。如此，科學家才得以看見「酵素動態過程」。

其中，「X 射線自由電子雷射」（X-ray free electron laser, XFEL），即為飛秒晶體學的關鍵主角。當觀測時間僅有飛秒等級時，就像拍攝狂奔中的美洲豹一樣，要在近乎瞬間的快門時間中看清拍攝物，此時的顯微鏡光源要非常非常明亮、同時也要有極快的光脈衝才能做到，XFEL 就是最佳選擇。

簡單來說，XFEL＝X 光＋自由電子雷射。自由電子雷射是近代產生高品質同調光的技術，1976 年由史丹佛大學的約翰·梅迪（John Madey）發明。我們把電子加速到接近光速，然後讓電子經過多個聚頻磁鐵（undulator），讓電子週期性地左右「搖擺」。此時，受到磁場「音浪」影響的電子會放出同步的電磁輻射，這些輻射在反射鏡打造的共振腔內來回反射和增強，產生高度同調（coherence）且光束集中的雷射光。

X 光是能量很高的光，為了要讓上述自由電子雷射裝置放出 X 光，我們必須要打造約 1 至 2 公里的直線加速器，讓電子累積足夠的能量，以及足夠的「搖擺」空間。但是因為 X 光幾乎無法用上述鏡面反射來增強，取而代之，我們需要放置更多的聚頻磁鐵，以實現自放大自發輻射（self-amplified spontaneous emission, SASE），最後才能得到時間間隔超短、同時也超亮的 X 光自由電子雷射（XFEL）。

因此，XFEL 裝置比起冷凍電子顯微鏡更加稀有和珍貴，要組裝全套的實驗設施，需要門檻極高。不但一個房間裝不下，甚至足球場也不夠裝！除了儀器精密，運轉 XFEL 還需要數百公尺以上的雷射加速跑道，耗費空間及成本相當驚人。

世界第一個 XFEL 設施位於美國 SLAC 國家加速器實驗室，2009 年開始啟用。隨後，日本、德國、韓國、瑞士也慢慢設立完成，目前只有這五個地方可以使用 XFEL，全世界都在競爭使用權，預約名額就像天文學的 ALMA（阿塔卡瑪大型毫米及次毫米波陣列）望遠鏡一樣稀有。蔡明道指出，研究團隊如果提案不夠好，沒有獲得 XFEL 團隊的青睞，就沒有做實驗的機會。開心的是，XFEL 團隊認可臺灣酵素研究的潛力，蔡明道帶領的臺灣蛋白質計畫團隊在日本與瑞士的設施陸續完成實驗。

本次 DNA 光解酶的論文成果，是國際合作的大型研究，論文作者高達 69 位，來自世界各地 17 個研究機構。因為要運作 XFEL 如此龐大的設施，同時也要設計與其對應的酵素實驗，需要許多人合作，包括日本、瑞士兩地設施的相關人士，以及臺灣的研究人員。整個研究計畫能看到許多跨國的知識與人才交流，例如論文第一作者馬左仲博士（Dr. Manuel Maestre-Reyna），他是在德國獲得博士學位的西班牙人，後來曾在中研院生化所擔任博士後研究員，目前則是國立臺灣大學化學系的助理教授，主導 XFEL 的相關實驗。

為什麼臺灣團隊的題目可以脫穎而出？又為什麼一定要用如此先進的 XFEL 技術呢？兩個問題其實是一體兩面。一旦貫通，便能理解這次重大突破的意義，進而體認該領域的未來潛力。

為酵素拍電影：不能只知開頭和結尾，更要看到中間的過程！

生命要正常運作，以及應付不同狀況，需要各式各樣的酵素（酶）催化各種化學反應。酵素其中一項重要功能是修復遺傳物質 DNA 的損傷。以長鍊形式存在的 DNA 會經歷多種損傷，一類普遍存在的損害結構稱為「環丁烷－嘧啶二聚體」（cyclobutane-pyrimidine dimer, CPD）；常見狀況是 DNA 序列上相鄰的兩個胸腺嘧啶（thymine）受到紫外線打擊後，結構上融合成一體。胸腺嘧啶縮寫為 T，故稱為「TT 二聚體」（TT dimer）。

光解酶（photolyase）便是專門修復上述損傷的酵素，它會來到發生事故的 DNA 分子附近，把打結的 DNA 修理好、斷開 TT 鎖鏈，再脫離目標。分子的結合、反應與再分離是極為短暫的動態過程，之前從來沒有人目睹該過程究竟如何進行。

事實上不只是光解酶，所有酵素整體上怎麼運作，都沒有人親眼看過。隨著顯微技術進步，如今人們要看見體積微小的酵素，已經不是問題。可是酵素反應經歷的時間太短，對人類而言幾乎是瞬間；但是它其實不是瞬間，只是非常非常迅速，快到過往所有的顯微鏡都來不及捕捉畫面；等到拍攝第二個畫面時，酵素早已完成工作。

既然是轉瞬即逝，詳細解析酵素作用的過程有什麼意義呢？蔡明道解釋，在生化學家眼中，化學反應的過程比結果更重要，掌握細節大有應用的潛力；例如化學合成與製藥，都有可能變得更加精確。

另一方面，蔡明道形容，酵素從開始催化到結束形成產物，就像一部電影，以前我們能看到開頭，也能見到片尾，得知結局為何，卻不知道中間的過程。身為求知慾旺盛的人類，難道我們不該試圖了解電影到底演了什麼嗎？

所謂連續的影片，其實是由一幅一幅畫面連貫而成，假如可以在酵素反應從頭到尾的過程拍到足夠多畫面，我們便能直接欣賞「酵素的電影」。研究團隊透過 XFEL 取得 18 幅畫面，人類總算首度能見識酵素作用的真實過程。

繞射先於破壞：用 XFEL 拍攝決定性的瞬間

傳統同步輻射光源的 X 光不夠亮，所以需要長時間照射在生物樣品上，來獲得足夠的光學繞射訊號。但同時會導致生物樣品的晶體結構被 X 光破壞，降低繞射資料的準確度。

而 XFEL 使用了同調雷射光，可以在極短時間產生超亮的 X 光脈衝，這種特性可以讓生物樣品在被 X 光破壞之前就產生繞射圖案，「繞射先於破壞」可以準確紀錄分子結構的資訊。

為了獲得足夠多的繞射資料，蔡明道團隊製備了很多微晶體，晶體內包含 DNA 光解酶和受損的 DNA，然後不斷地讓微晶體以隨機方向落下、通過 XFEL，此時每個光脈衝都會取得一個微晶體的繞射圖案，隨後該微晶體被強光破壞，再換下一個新的微晶體，以此類推。透過分析成千上萬個重疊的繞射圖案，就可以重建出微晶體裡面的分子結構。

要注意的是，實驗用的「受損 DNA」是人工合成，光解酶（DNA 修復酵素）則是來自一種古菌 Methanosarcina mazei，之所以這樣做的原因是為了方便在實驗中觀察，這種光解酶和受損 DNA 可以大量製備成微晶體，並且條件可控。

為什麼選擇光解酶作分析對象？蔡明道解釋，除了功能重要以外，最重要的理由是酵素由光驅動。畢竟 XFEL 技術說穿了就是如何打光，要捕捉決定性的瞬間，勢必要精準掌握酵素作用的起始時間點，光解酶就相當適合。

因此「用 XFEL 研究光解酶」可謂一體兩面，材料與方法的相輔相成。但是，這個威力強大的研究方法難道只能用在光解酶，其他種類的酵素無法使用嗎？蔡明道認為這個問題可以克服，如果透過化學合成，將反應物加上光驅動的特性，那麼超快超亮的 XFEL 將無往不利，看透各種酵素的反應過程。

蔡明道強調，以往顯微鏡拍攝的酵素影像，不論空間尺度達到多麼細微，例如冷凍電子顯微鏡，依然是靜態的結構。相對地，XFEL 取得的畫面雖然來自同一個反應過程，但是每一幅定格的瞬間，卻都是前所未見的全新結構。

轉瞬即逝：拆解酵素催化反應的動態過程

本研究捕捉到的 18 個光解酶作用畫面，在時間序列上並非平均分佈，而是經過初步測試後決定的特定時間點。整個過程可以分為三個階段：第一階段是修復 DNA，第二階段為酵素活化位置恢復，第三階段為 DNA 回復原本形狀、酵素脫離。

三個階段的時間差異很大，假如以「奈秒」（ns，10^-9 秒）計量，在酵素啟動的 10 奈秒之內， DNA 損傷就修復完畢。接下來活化位置的恢復，大概完成於 500 奈秒後。最後被修好的 DNA 回歸雙螺旋就位，酵素脫離，反應結束，需要經歷 20 萬奈秒。

XFEL 能分辨更短的時間點，因此可以進一步剖析時間最短的第一階段內，DNA 損傷經歷哪些修復步驟。這些觀察顯示，酵素具體的催化過程比以前認為的複雜。

事實上，以前科學家對酵素的作用當然不是一無所知，有許多理論計算與間接推測；卻還是要實際看到，才能釐清理論與模型的精確程度。實驗所得的新知，無疑有助於完善理論，拓展「酵素學」的知識疆界。

從生物的角度思考，保持遺傳物質的穩定至關重要，DNA 一旦發生損傷，最好能現在、立刻、馬上修復，否則後果難料。因此從 XFEL 的證據來看，生物體遭到紫外線打擊，DNA 形成 TT 二聚體以後，只會存在極短的時間，然後酵素便會在「皮秒」（ps，10^-12 秒）的量級啟動修復過程，接著經過一系列小步驟讓 DNA 恢復原狀，可謂合理。而這些轉瞬即逝的一系列小步驟，都要仰賴 XFEL 才能知曉。

好的科學研究，就是回答重要的問題

要解答科學問題，需要有合適的分析方法。投身研究多年，經驗豐富的蔡明道，依然持續追逐新的技術。他回顧當初在美國的俄亥俄州立大學（The Ohio State University）工作時，便掌管貴重儀器中心，熟悉質譜儀、核磁共振（NMR），親身體驗不斷推動生物結構學進展的這些技術。

蔡明道 2003 年回到臺灣加入中研院後，除了自己鑽研的酵素學、生物化學以外，也大力推動技術升級。冷凍電子顯微鏡、XFEL 研究都已經做出成績。他強調，冷凍電子顯微鏡等新技術雖然昂貴，但是沒有這些高貴的設備，便無法進行更深入的研究，中研院之前建立的冷凍電子顯微鏡設施，現在正持續收穫成果。

在使用 XFEL 解析光解酶的催化過程後，蔡明道不打算停下腳步，他立刻迎向下一個挑戰。團隊新的解析對象是另一種蛋白質：隱花色素（cryptochrome）。儘管名字有色素，但隱花色素對生物的關鍵意義不在於呈現顏色，而是感應磁場。蔡明道覺得這個問題不但重要，也相當有趣。

光解酶這項研究可以視為用「創新的方法」突破「重要的問題」。這讓研之有物團隊好奇，如果把科學研究分為解決問題與研究方法，它們的關係是什麼？

蔡明道的觀點是，不同科學家可以走不同方向，有些人專心研發新的方法，有些人著重鑽研問題。新的方法或許可以回答未解之謎，但是要做出好的研究，一定要先有「重要的問題」。而為了回答重要的問題，自然不會滿足於現狀，會持續追求更新更好的方法。因此，從重要問題出發，找到創新的解決方法與答案，再取得前沿的研究成果，就是蔡明道一直以來的研究理念。